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RNA杂交预杂交液/杂交液（100 mL，含50%甲酰胺）
RNA杂交预杂交液/杂交液（100 mL，含50%甲酰胺）
基本属性
| 属性 | 内容 |
|---|---|
| 产品名称 | RNA杂交预杂交液/杂交液（含甲酰胺） |
| 规格 | 100 mL |
| 主要用途 | Northern Blot预杂交与杂交孵育（RNA检测） |
| 保存条件 | -20 ℃避光保存（甲酰胺对光敏感） |
| 关键要求 | 所有试剂及耗材均须RNase-free |
配方组成（100 mL体系）
| 组分 | 用量 | 工作浓度 | CAS号（如适用） |
|---|---|---|---|
| 20×SSC（或SSPE） | 30 mL | 6× | — |
| 50×Denhardt's | 10 mL | 5× | — |
| 10% SDS | 5 mL | 0.5%（W/V） | 25155-30-0 |
| 甲酰胺（Formamide） | 50 mL | 50%（V/V） | 75-12-7 |
| 10 mg/mL Salmon DNA | 1 mL | 100 μg/mL | 438545-06-3 |
| dH₂O（DEPC处理） | 4 mL | — | — |
配制步骤
（关键步骤） 将10 mg/mL Salmon DNA储备液于沸水浴中加热10分钟变性，迅速冰浴冷却后备用。
在RNase-free操作条件下，按上表依次量取以下组分至200 mL RNase-free烧杯中：
30 mL 20×SSC（或SSPE）
10 mL 50×Denhardt's
5 mL 10% SDS
50 mL 甲酰胺（Formamide）
1 mL 变性Salmon DNA
4 mL DEPC处理dH₂O
充分混匀后，使用0.45 μm滤器过滤除杂。
-20 ℃避光分装保存。
与DNA杂交液的关键区别
| 比较项 | DNA杂交液 | RNA杂交液（本配方） |
|---|---|---|
| 甲酰胺 | ❌ 无 | ✅ 50% |
| RNase控制 | 无特殊要求 | ✅ 严格RNase-free |
| 典型杂交温度 | 65～68 ℃ | 42 ℃（含甲酰胺） |
| 主要应用 | Southern Blot | Northern Blot |
关键注意事项
RNase-free是绝对要求：所有试剂、枪头、离心管、移液器、操作台面必须为RNase-free。DEPC处理水配制所有组分，操作时佩戴手套，避免皮肤和唾液中的RNase污染样品。
甲酰胺光敏感性：甲酰胺对光敏感，且反复冻融会降解产生甲酸，影响杂交严谨性。建议分装后-20 ℃避光保存，避免反复冻融。
甲酰胺毒性：甲酰胺为致畸物，操作时必须在通风橱内进行，佩戴手套和护目镜。避免吸入蒸气。
鲑鱼精DNA前处理：使用前必须煮沸变性10分钟并迅速冰浴冷却，使其成为单链短片段，方可有效封闭膜上的非特异性位点。未变性的Salmon DNA不具备封闭功能。
过滤除杂：使用0.45 μm滤器过滤，去除SDS低温析出结晶及Denhardt's溶液中的不溶物。不可高压灭菌。
SDS低温析出：若配制后出现沉淀，37℃水浴加热溶解即可，不影响使用。
预杂交与杂交操作流程
| 步骤 | 溶液 | 温度 | 时间 |
|---|---|---|---|
| 预杂交 | 本溶液（不含探针） | 42 ℃ | 2～4小时 |
| 杂交 | 本溶液（含变性RNA探针） | 42 ℃ | 12～16小时（过夜） |
💡 甲酰胺可降低DNA/RNA杂交的Tm值，使杂交在较低温度（42 ℃）下进行，有效保护RNA靶标不被降解
