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PAGE 凝胶贮存液配制方案
PAGE 凝胶贮存液配制方案
产品概述
PAGE凝胶是聚丙烯酰胺凝胶电泳的核心耗材，用于蛋白质（SDS-PAGE）和核酸（DNA/RNA PAGE）的高分辨率分离。本方案以30% Acrylamide（29:1）、5×TBE缓冲液为基料，通过调整凝胶浓度实现对不同分子量目标物的精准分离，适用于DNA测序、SSR标记检测、蛋白纯度分析等实验。
凝胶浓度与适用分子范围：
| 凝胶浓度 | 最佳分离范围（DNA，bp） | 最佳分离范围（蛋白，kDa） | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| 3.5% | 1,000～10,000+ | >200 | 大片段DNA/超大蛋白、脉冲场电泳 |
| 5% | 500～10,000 | 100～300 | 大片段DNA、高分子量蛋白 |
| 8% | 100～2,000 | 40～200 | DNA测序胶、常规蛋白SDS-PAGE |
| 12% | 50～800 | 14～100 | 小片段DNA、常规蛋白分析 |
| 20% | 10～200 | <30 | 寡核苷酸、小分子多肽、miRNA |
胶浓度配方表
下表为配制60 mL凝胶溶液的组分用量（含分离胶及添加剂*）：
| 组分 | 3.5%胶 | 5%胶 | 8%胶 | 12%胶 | 20%胶 |
|---|---|---|---|---|---|
| H₂O（mL） | 40.8 | 39.4 | 35.9 | 31.0 | 20.0 |
| 30% Acrylamide（mL） | 7.0 | 10.0 | 16.0 | 24.0 | 40.0 |
| 5×TBE（mL） | 12.0 | 12.0 | 12.0 | 12.0 | 12.0 |
| 10% APS（mL） | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| TEMED（mL） | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 |
*注：上表为含APS和TEMED的完整凝胶溶液用量。若作为“贮存液”（不含引发剂）保存，则不加APS和TEMED，仅配制Acrylamide + TBE + H₂O的混合液，4℃避光保存。
实际体积可按比例调整（如制备30 mL则所有用量减半）。
配制步骤
贮存液配制（不含引发剂，可预存）
按配方表精准量取H₂O、30% Acrylamide（29:1）、5×TBE，置于洁净烧杯中，低速搅拌混匀（避免气泡）。
转移至棕色瓶中，4 ℃避光保存。
临用前取所需体积，加入10% APS和TEMED。
凝胶配制（含引发剂，即配即用）
取上述混合液，加入对应体积10% APS，快速混匀。
临灌胶前加入TEMED，立即轻轻颠倒混匀（聚合反应即刻启动，需快速操作）。
将混合液缓慢注入电泳胶板间隙，插入梳子，室温（25 ℃）静置30～60 min至完全聚合。
聚合完成后小心拔梳，用1×TBE冲洗加样孔，去除未聚合残留，备用。
关键注意事项
| 要点 | 说明 |
|---|---|
| ⚠️ 神经毒性 | 丙烯酰胺为神经毒性物质，操作全程戴手套、口罩、护目镜，避免皮肤接触或吸入粉尘 |
| ⚠️ APS现配现用 | 10% APS需现配现用（或4℃保存≤1周），失效会导致凝胶聚合失败 |
| ⚠️ TEMED保存 | TEMED开封后密封4℃避光保存，避免挥发失效 |
| ⚠️ 温度调控 | 室温＜20℃可适当增加APS/TEMED用量；＞30℃减少用量，防止聚合过快开裂或过慢不完全 |
| ⚠️ 浓度选择 | 小片段核酸（＜500 bp）选12%–20%；大片段（＞10 kb）选3.5%–5% |
稀释使用指南——5×TBE → 1×TBE
| 需要1×TBE体积 | 5×TBE用量 | 去离子水用量 |
|---|---|---|
| 100 mL | 20 mL | 80 mL |
| 200 mL | 40 mL | 160 mL |
| 500 mL | 100 mL | 400 mL |
| 1 L | 200 mL | 800 mL |
💡 电泳运行缓冲液和冲洗加样孔均使用1×TBE工作液（5×TBE稀释5倍）。
主要应用
| 应用 | 推荐胶浓度 |
|---|---|
| DNA测序（Sanger测序胶） | 8% |
| SSR/AFLP分子标记检测 | 8%–12% |
| 小片段DNA/寡核苷酸分离（＜500 bp） | 12%–20% |
| miRNA分析 | 15%–20% |
| SDS-PAGE蛋白电泳 | 依蛋白分子量选择8%–15% |
| 大片段DNA分析（＞10 kb） | 3.5%–5% |
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