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DNase I溶液：从配制到使用，一篇讲透RNA去基因组DNA的关键步骤
DNase I溶液：从配制到使用，一篇讲透RNA去基因组DNA的关键步骤
做RNA实验最怕什么？提完RNA跑胶一看——28S和18S条带倒是清晰，但基因组DNA的条带也明晃晃地在那里。qPCR内参Ct值异常、反转录效率忽高忽低……所有问题都指向同一个根源：你的RNA样本里混进了基因组DNA。
DNase I处理是解决这个问题的“标准答案” 。但问题来了——DNase I本身怎么配、怎么用，很多实验党却搞不清楚。
今天一次性把DNase I的配方、配制逻辑和坑点讲明白。
一、DNase I是什么？——一把“专切DNA的剪刀”
DNase I（脱氧核糖核酸酶I）是一种依赖二价阳离子的核酸内切酶。它能水解单链或双链DNA的磷酸二酯键，产生带有5‘-磷酸基团和3’-OH末端的寡核苷酸。
在RNA提取和蛋白质纯化中，它的核心任务只有一个：把样品里的基因组DNA彻底清除，不让它污染你的RNA或蛋白。
你可以把它想象成一把只切DNA、不动RNA的精密剪刀——但它有个特点：活性严格依赖Mg²⁺或Mn²⁺等二价阳离子。
二、一张表看懂DNase I的核心配方
DNase I的配制分为储存液（长期保存） 和工作液（现用现配） 两个层级。市面上常用的配制方案有以下几种【1】【2】：
| 配方方案 | 储存液溶剂/缓冲液 | 关键添加剂 | 终浓度 | 保存条件 | 来源/适用场景 |
|---|---|---|---|---|---|
| 方案一（水溶法） | RNase-Free ddH₂O | 无 | 约2700 U/mL（1500 U/550 μL） | -20℃保存9个月；4℃可保存6周 | 天根DNase I干粉配制方案 |
| 方案二（Tris-HCl+甘油法） | 20 mM Tris-HCl（pH 7.5） | + 50%甘油（部分版本含1 mM MgCl₂，部分不含） | 10 U/μL | -20℃保存，避免反复冻融 | GoldBio蛋白纯化用DNase I储存液 |
| 方案三（Tris+甘油+NaCl法） | 20 mM Tris（pH 7.5） | 50%甘油 + 50 mM NaCl | 20,000 U/mL | -20℃分装保存 | PMC文献，用于DNase I足迹实验等 |
| 方案四（稀HCl+甘油法） | 0.0025 N HCl（若担心酸处理对RNA的影响，可改用10 mM Tris-HCl（pH 7.5）配制） | 50%甘油 | 2 mg/mL | -20℃保存 | CSH Protocols经典配方 |
| 方案五（纯水法） | 灭菌Milli-Q H₂O | 无 | 10 mg/mL | 4℃保存2个月 | CSH Protocols（2024），用于防止细胞聚集 |
💡 为什么储存液要加甘油？
甘油是DNase I的“保护剂”。DNase I在反复冻融过程中容易失活，加入50%（v/v）甘油后，溶液在-20℃不会结冰，可以避免冻融损伤，同时保持酶活性稳定。如果不用甘油保护，建议小量分装后-20℃冻存，每管只取一次用量。
⚠️ 方案选择建议
如果你买的是干粉（如天根RT411）：按方案一，用试剂盒配套的RNase-Free ddH₂O溶解即可
如果你买的是高浓度酶液、需要长期保存：推荐方案二或方案三，加甘油防冻保护【3】
如果短期使用（2个月内） ：方案五最省事，纯水溶解后4℃保存即可
三、配制步骤（照着做，不踩坑）
以最常见的方案一（天根DNase I干粉溶解法） 为例：
| 步骤 | 操作 | 关键提醒 |
|---|---|---|
| Step 1 | 准备RNase-Free的ddH₂O、移液器和无菌枪头 | 注意：DNase I干粉有时会形成一层薄膜贴在瓶壁上，肉眼看起来像是空的——请不要误以为瓶子是空的而打开瓶盖造成损失 |
| Step 2 | 用RNase-Free注射器将550 μL RNase-Free ddH₂O注射进DNase I干粉瓶中（1500 U），颠倒混匀使DNase I完全溶解 | 轻柔颠倒混匀，或低速短时涡旋（不超过3秒） 。避免剧烈、长时间振荡 |
| Step 3 | 将溶解后的DNase I储存液分装成小份（建议每管20-50 μL），-20℃冻存 | — |
| Step 4 | 工作液的配制（以柱上式RNA提取为例）：每个样品取10 μL DNase I储存液，加入70 μL Buffer RDD（即用型1×缓冲液），轻柔混匀 | — |
四、🔑 实验党必看的关键提醒
1. 金属离子是“启动开关”
DNase I的活性严格依赖Mg²⁺或Mn²⁺。反应体系中必须含有这些二价阳离子，否则酶“有劲使不出”。
2. EDTA是“终止按钮”
要终止DNase I反应，加入EDTA即可——EDTA螯合掉Mg²⁺等二价阳离子，酶瞬间失活。也可以65℃加热10分钟灭活。
3. 用量参考
一般1 U DNase I可消化小于1 μg的DNA。Thermo Fisher推荐每10 μg RNA使用2 U DNase I。具体用量需根据实验优化。
4. 融化的储存液不要再冻回去
从-20℃取出的DNase I储存液融化后，应置于4℃保存（可保存6周） ，不要再次冻存。反复冻融会导致活性大幅下降。
5. DNase I ≠ RNase-Free DNase I
普通DNase I可能含有RNase污染，用于RNA样品处理时，务必选择“RNase-Free”级别的DNase I。
6. DNase I处理后的RNA回收不可省略
反应结束后，推荐采用柱式纯化方式，将反应液直接过RNA纯化柱，洗涤后洗脱RNA，DNase I被完全去除。如需溶液内处理，可采用65℃加热10分钟灭活，但需注意高温可能导致RNA降解；或加入EDTA至终浓度2.5 mM终止反应，但后续反转录时需注意EDTA对Mg²⁺的螯合作用，建议适当增加反转录体系中Mg²⁺的补加量。
五、省心之选：直接买现成的
自己配DNase I涉及干粉溶解、分装、浓度计算、RNase污染防控等多个环节，每一步都可能引入误差或污染。如果追求省心省力，可以直接选择商品化即用型DNase I溶液。
杭州富沃克生物科技有限公司推出的DNase I溶液（RNase-Free），直接帮你省掉所有配制步骤。产品经过严格纯化处理，不含RNase，开盖即用，无需自行溶解和分装。你只需要根据实验需求，直接取用配制工作液即可。
把配制的麻烦交给专业厂家，把时间留给真正重要的实验——毕竟，实验最大的成本不是试剂，是你的时间。
📦 产品信息：
| 产品名称 | 规格 | 产品货号 |
|---|---|---|
| DNase I（RNase-Free） | 1 mL（200 U） | FDN606-01 |
📞 厂家联系微信号：19850855600
📧 邮箱：support@fwkbio.com
🔗 官网链接：DNase I-杭州富沃克生物科技有限公司
参考文献
[1] DNase I Solution (10 mg/mL). Cold Spring Harbor Protocols, 2024.
[2] STAR Protoc. 2022 Dec 9;3(4):101914. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101914.
[3] DNase I Stock Solution for Protein Purification. GoldBio.
