苯酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1）配制方案

产品概述

苯酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1）是分子生物学实验中最为经典的核酸纯化抽提试剂组合，广泛应用于DNA和RNA提取中的蛋白质去除步骤。苯酚使蛋白质变性并沉淀于有机相与水相交界面，氯仿增强蛋白质变性效果并促进有机相与水相的清晰分离，异戊醇则有效消除抽提过程中产生的气泡并降低表面张力，防止乳化现象发生。本品由Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇按特定比例混合配制，确保抽提体系处于中性pH环境，最大限度保护核酸完整性。苯酚/氯仿具有剧毒性和强腐蚀性，配制全过程须在通风橱内严格遵守安全操作规范。

组分说明

各组分核心功能详解：

• Tris-HCl平衡苯酚：使蛋白质分子内氢键断裂而发生变性，蛋白质从水相转移至有机相或沉淀于两相界面，实现核酸与蛋白质的高效分离。经Tris-HCl平衡至pH ≥ 7.8，确保核酸（尤其是DNA）在水相中稳定存在，避免酸性条件下DNA分配至有机相造成损失。

• 氯仿：辅助变性蛋白质，增加有机相密度，使有机相与水相分层更清晰、界面更紧密，便于水相回收。同时氯仿可萃取残留的苯酚，减少水相中苯酚污染。

• 异戊醇：作为消泡剂，降低抽提过程中的气泡产生；同时降低有机相表面张力，减少乳化层形成，使离心后三相（上层水相、中间蛋白层、下层有机相）界限分明，便于水相安全吸取。

配制流程

1. 预先配制氯仿/异戊醇混合液（24 : 1）

2. 配制苯酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1）

📌 简便配比参考：若需配制总体积100 mL，可取50 mL Tris-HCl平衡苯酚 + 48 mL氯仿 + 2 mL异戊醇，混合均匀即可。

操作要点与注意事项

1. 安全防护（重中之重）
苯酚/氯仿/异戊醇混合液具有剧毒性和强腐蚀性。所有操作必须在通风橱内完成，操作者必须佩戴耐化学品手套、防护眼镜、实验服。严禁在通风橱外进行任何涉及该试剂的开放操作。

2. 皮肤接触紧急处理
若不慎将溶液溅到皮肤上，应立即用大量清水冲洗至少15分钟，再用肥皂和水洗涤，严禁使用乙醇清洗（乙醇会加速有毒物质经皮渗透，加重损伤）。严重接触后应立即就医。

3. 抽吸操作规范
核酸抽提离心后，体系分为三层：上层为含核酸的水相（无色），中间为变性蛋白质的白色絮状层，下层为有机相（黄色）。吸取水相时，应使用移液器或移液管从上层小心吸取，严禁触碰中间蛋白层，避免蛋白质污染带入核酸样品。

4. 乳化处理
若抽提过程中出现乳化（水相与有机相混合形成乳浊液），可适当增加异戊醇比例（不超过总体积5%）或延长离心时间（12,000 rpm，5分钟）辅助分层。剧烈振荡虽可提高抽提效率，但会增加乳化风险，操作时需平衡效率与分层效果。

5. 保存规范

• 配制好的混合液应保存于棕色玻璃瓶中，4 ℃避光密封保存。

• 保存期间若有机相颜色变深（深黄、橘红）或出现沉淀，表明苯酚已氧化，应废弃重配。

• 正常情况下，含8-羟基喹啉的有机相呈浅黄色。

• 建议现配现用，配制后1个月内使用完毕为佳；长期保存时，有机相上层可覆盖少量0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液作为保护层，减少氧化与挥发。

6. 废弃处理
苯酚/氯仿混合液属于剧毒危险废弃物，废液及接触过的枪头、耗材应按照实验室危险废弃物管理规范分类收集，统一交由专业机构处理，严禁直接排入下水道。

应用场景

本品适用于各类核酸提取实验中的蛋白质去除步骤，包括但不限于：

• RNA提取：TRIzol法抽提后，用于去除水相中的蛋白质与基因组DNA污染。

• 质粒DNA纯化：质粒大量提取中去除裂解液中的蛋白质与SDS残留。

• 基因组DNA制备：动物组织、植物组织或细菌基因组DNA提取中的酚抽提步骤。

• 其他分子生物学操作：需要高纯度核酸样本时的通用蛋白去除方案